Evolución de virus de ADN de cadena sencilla, patogénesis y potencial anti-cáncer
Resumen de Investigación:
Investigamos la biología molecular de los virus ssDNA, con especial énfasis en los miembros de la familia Parvoviridae, para comprender sus patrones de evolución, los mecanismos subyacentes a su patogenicidad, las etapas de su ciclo vital, y su potencial oncolítico contra cáncer humano.
Patogenicidad.
En estos estudios combinamos infecciones de ratones con análisis de secuencia de variantes genéticas del parvovirus diminuto del ratón (MVM) que surgen en etapas precisas de las enfermedades que causa. La capacidad evolutiva de este virus en respuesta a presiones inmunes y adaptativas se monitoriza mediante la secuenciación de los genomas. Esto permite en ocasiones la localización de los cambios de aminoácidos seleccionados en dominios funcionales de la estructura tridimensional de la cápsida (Figura 1).
Figura 1. A. Localización de mutaciones resistentes a anticuerpos monoclonales en la cápsida del parvovirus MVMi. B. Una constelación de residuos en el eje de simetría de orden 2 de la cápsida MVM contribuyen a la enfermedad hemapoyética causada por el virus en ratones scid.
Ciclo Vital del parvovirus MVM.
Estudiamos la capacidad de infección preferente de células de cáncer (oncolisis) del MVM, mediante un análisis en profundidad de los pasos del ciclo de vida del virus en células cancerosas humanas, con el objetivo de identificar reguladores e interacciones moleculares precisas en cada una de las etapas principales. Así demostramos como el ensamblaje de la cápsida ocurre gracias a la translocación de intermedios triméricos a través de la envoltura nuclear durante la fase S del ciclo celular, y como el transporte de estos trímeros depende de la fosforilación de las subunidades de la cápsida en sitios específicos (Figura 2A) mediada por la quinasa Raf-1 (ruta MAPK) que se desregula en células cancerosas (Figura 2B).
Figura 2. Pasos principales en el ciclo de vida de MVM de parvovirus. A. Fosforilación en sitios específicos de las subunidades de la cápsida VP2 y VP1. B. Reguladores del ciclo vital del MVM relevantes en cáncer humano.
Un aspecto de la regulación del ciclo vital del MVM de especial interés para su capacidad oncolítica es la dependencia por la fase S del transporte de las subunidades de la cápsida, y por tanto del ensamblaje nuclear del virus (Figura 3). Este acoplamiento es relevante para comprender la patogénesis y el tropismo de parvovirus por células proliferativas. Su alteración puede determinar la persistencia viral en los tejidos del hospedador.
Figura 3. Acoplamiento temporal y funcional entre el ciclo celular y el ensamblaje nuclear de parvovirus.
La evolución de MVM confiere propiedades ventajosas contra glioblastoma.
Estamos intentando mejorar el tropismo del MVM por las células cancerosas mediante múltiples estrategias experimentales: (i) Bajo evolución natural en ratones, surgen variantes de MVM que contienen cambios amino-acídicos en la depresión del eje de simetría de orden 2 de la cápsida (dimple). Algunos de estos virus modulan la afinidad de unión al receptor celular de ácido siálico (sia) y muestran una mejor infectividad de células de glioblastoma. La base molecular de esta mejora en el onco-tropismo está relacionada con un importante efecto de los contactos del tipo de sia sobre el tráfico endocítico del virión. (ii) Hemos desarrollado varias estrategias de evolución dirigida in vitro, basadas en la generación de genotecas del MVM por mutagénesis (PCRs proclives al error o saturación de codones precisos) del sitio de unión al receptor celular y posterior adaptación a células de glioblastoma mediante pases seriados. El objetivo es re-dirigir la cápsida de MVM hacia sialoglicanos expresados preferentemente en líneas celulares de glioblastoma. Algunos de los virus recombinantes diseñados con las mutaciones seleccionadas (Figura 6) se replican y propagan mejor que el virus de tipo salvaje en la línea celular de glioblastoma U373 (iii). Por último, estamos fomentando la recombinación entre las cepas MVMp y MVMi mediante una alta multiplicidad de coinfección de células permisivas. Los virus quiméricos onco-trópicos de MVM que surgen espontáneamente en estos cultivos se someten a selección en células U373. Uno de los virus resultantes presenta proteínas no estructurales quiméricas y produce más genomas virales en U373 que las dos cepas parentales, lo que sugiere un mayor oncotropismo.
Aplicaciones anti-cáncer del parvovirus MVM.
El potencial terapéutico anti-cancer del MVM quedó demostrado por su capacidad para infectar y eliminar células madre de cáncer obtenidas de pacientes con glioblastoma (el tumor cerebral más agresivo) implantadas en el cerebro de modelos de roedores (Figura 4). En las neuroesferas, el MVM dirige su acción citotóxica exclusivamente contra aquellas células que tienen alteradas tanto las respuestas innatas como el regulador central p53 por mutación o fosforilación aberrante, de forma dependiente de paciente. Estos resultados abren la esperanza de una nueva medicina personalizada y biosegura, basada en virus que infectan selectivamente células madre malignas, que podría utilizarse en terapias contra este devastador tipo de cáncer y contra otros que lleven desregulada la señalización de p53.
Figura 4. Capacidad terapéutica de MVM contra tumores cerebrales derivados de GSC en ratones. A. Esquema de la metodología. B. Imágenes de resonancia magnética de tumores cerebrales a los 60 d post-implantación. C. Crecimiento tumoral y análisis de supervivencia de Kaplan-Meyer de los ratones implantados.
Otras aproximaciones en marcha en nuestro laboratorio para mejorar la oncólisis del MVM consisten en re-direccionar el virus hacia al proceso de neo-vascularización, que ocurre durante el crecimiento tumoral. Estamos diseñando diferentes dominios de la cápsida del MVM con péptidos heterólogos que bloquean el VEGF (Figura 5A), bien para inducir anticuerpos que puedan reducir el crecimiento tumoral (Figura 5B), o para dirigir el tropismo del virus específicamente a las células endoteliales que expresan VEGF-R y que sostienen la red vascular del tumor (Figura 5C).
Figura 5. Manipulaciones de la cápsida de MVM con péptidos heterólogos. A. Dominios de la cápsida de MVM manipulados con péptidos que bloquean VEGF. B. Los cuatro bucles que configuran la espícula en el eje de simetría 3x sustituidos por péptidos. C. Los péptidos ayudan a entender el mecanismo de entrada del virus dependiente del receptor siálico.
Figura 6. Mutantes de MVM obtenidos por evolución dirigida hacia una línea de glioblastoma humano muestran cambios de aminoácidos en la cápsida próximos al sitio de unión del receptor de ácido siálico. Estructura 3D de la cápsida de MVM con los residuos coloreados de rojo a azul en función de la distancia al centro de la partícula. Se indican los ejes de simetría 3x (“espícula”), 5x (“poro”) y 2x (“hoyuelo”), así como una imagen aumentada de ésta última región en cuatro de los mutantes con los residuos alterados indicados con una flecha.
Fuentes de financiación en los últimos años:
- “Re-targeting parvovirus infection to cellular processes determining human cancer”. PID2022-141799OB-I00. Ministerio de Innovación y Ciencia. Principal investigator: J.M. Almendral. Sep 2023-Ago 2026.
- “Directed parvovirus evolution aimed at human cancer therapy”. PID2019-111146RB-I00. Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades. Principal investigators: A. López-Bueno and J.M. Almendral. Jun 2020-Nov 2023.
- “Plataformas y modelos preclínicos para el abordaje multidisciplinar en COVID-19 y en respuesta a futuras pandemias”. COVTRAVI-19-CM. Coordinator: Manuel Fresno. Principal investigators: López-Bueno and J.M. Almendral. Feb 2022-Dec 2022.
- “Use of nonionizing radiation (modulation) to enhance cancer treatment with oncolytic viruses: effects on cell viability and signaling pathways in tumor models”. Paso Alto Biophysics and Biomedical Engineering S.L., Principal investigators: Y. Revilla and J.M. Almendral. Nov 2022-Dec 2023.
Apellidos | Nombre | Laboratorio | Ext.* | Categoría profesional | |
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Almendral del Río | José Mª | 224 | 4559 | jmalmendral(at)cbm.csic.es | Catedrático Universidad, GA |
Fernández Llorente | Alejandro | 224 | 4559 | alejandro.fernandez(at)cbm.csic.es | Titulado Sup.de Actividades Técn. y Profes. GP1 |
Flechoso Fernández | Gonzalo | 224 | 4559 | Estudiante TFM | |
Gutiérrez Fombona | María | 224 | 4589 | maria.gutierrez(at)cbm.csic.es | Titulado Sup.de Actividades Técn. y Profes. GP1 |
López Bueno | Alberto | 224 | 4589 | alopezbueno(at)cbm.csic.es | Profesor Titular Universidad, GA |
Martínez Ortega | Jorge | 224 | 4589 | j.martinez(at)cbm.csic.es | Titulado Sup.de Actividades Técn. y Profes. GP1 |
Ruiz Medina | Ana | 224 | 4559 | Estudiante |
Publicaciones relevantes:
- Castellanos, M., Pérez, R., Rodríguez-Huete, A., Grueso, E., Almendral, J.M*., and Mateu, M.G*. 2013. A slender tract of glycines is required for translocation of protein VP2 N-terminal domain through the parvovirus MVM capsid channel to initiate infection. Biochem J,. 455, 87-94 (*, co-directors). https://doi.org/10.1042/BJ20130503
- Almendral, J.M. 2013. Assembly of simple icosahedral viruses. Subcell Biochem book series 68: 307-328. doi: https://doi.org/10.1007/978-94-007-6552-8_10
- Gil-Ranedo, , Hernando, E., Riolobos, L., Domínguez, C., Kann, M., and J.M. Almendral. 2015. The mammalian cell cycle regulates parvovirus nuclear capsid assembly. Plos Pathogens. 11;11(6):e1004920. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004920.
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- Calvo-López T, Grueso E, Sánchez-Martínez C, Almendral JM. Intracellular virion traffic to the endosome driven by cell type specific sialic acid receptors determines parvovirus tropism. Front Microbiol. Jan 23;13:1063706. https://doi.org/10.3389/fmicb.2022.1063706.
- Mietzsch M, Qiu J, Almendral JM and Söderlund-Venermo M (2023) Editorial: Parvoviruses: from basic research to biomedical and biotechnological applications. Microbiol. 14:1194926. https://doi.org/10.3389/fmicb.2023.1194926.
- López-Bueno A, Gil-Ranedo J, Almendral JM. 2024. Chapter 10: Assembly of small icosahedral viruses. Structure and Physics of Viruses. In press in Subcell Biochem book series.
Tesis doctorales:
- Tania Calvo-López. 2021. “Ingeniería de dominios funcionales de la cápsida del parvovirus MVM con péptidos que bloquean VEGF: efectos en ensamblaje, inmunogenicidad y tropismo”. UAM. Director: JM Almendral.
- Carlos Gallego García. 2020. “Terapia de glioblastoma por el parvovirus MVM: implicación de p53 y su modulación por quimioterapia genotóxica”. UAM. Director: JM Almendral.
- Marcos Parras Moltó. 2019. “Estudio metagenómico de la comunidad de virus y de su interacción con la microbiota en la cavidad bucal humana”. UAM. Director: Alberto López Bueno.
- Nooshin Bayat. 2018. “Modificaciones de la cápsida de parvovirus en la entrada de células de cáncer e invasión evolutiva de genomas de primates/Parvovirus capsid modifications in cancer cell entry and evolutionary invasion of primate genomes”. UAM. Director: JM Almendral.