Martes, 12 de Diciembre de 2017
    MICROSCOPÍA ÓPTICA Y CONFOCAL
 

Coordinador Científico:
Fco. Javier Díez-Guerra
Responsable Técnico:
Ángeles Muñoz

 

Microscopía Óptica y Confocal

 

SMOC

 

Comunidad de Madrid

 

ÚLTIMAS NOTICIAS

  • 07-12-2017: LSM510 Vertical reparado. Se ha cambiado el escáner X y el láser de Argón (línea 488).
  • 17-11-2017: Disponible de nuevo eescáner resonante del confocal Nikon A1R.
  • 16-11-2017: Apertura   confocal LSM800 a partir del lunes 20. Para realizar las reservas y organizar las sesiones de formación y asistencia, dirigirse al SMOC (lab 310).
  • 09-02-2017 Láser Maitai del Multifotón fuera de servicio. El equipo se puede utilizar como confocal.
 

ENLACES - PROTOCOLOS - FIJACIÓN

 

Formaldehyde, a partir de Paraformaldehyde (PFA)

  • Preparación:
    1. Disolver paraformaldehido al 4% (= 10% formalina) en agua destilada precalentada a 55-60ºC
    2. Añadir unas gotas de NaOH 1M y agitar hasta disolver totalmente
    3. Enfriar hasta temperatura ambiente (RT). Añadir PBS hasta 1X y llevar el pH a 7.4
    4. Utilizar esta solución fresca, con no más de 1 semana a RT
  • Uso (se puede combinar con microondas)(ver la segunda referencia de arriba):
    1. Lavar los cubres con PBS y fijar 20-30' con PFA 4% añadiéndolo lentamente
    2. Lavar los cubres con PBS (3x5')
    3. Guardar los cubres fijados a 4ºC en PBS con 0.01 % Azida o comenzar la inmunofluorescencia

Formaldehyde - Acetona

  1. Lavar los cubres con PBS a 37ºC
  2. Fijar las células con PFA 4% en PBS durante 10' a RT
  3. Lavar las células con PBS (3x5')
  4. Permeabilizar las células con acetona a -20ºC durante 10'. Desarrollar la incubación a -20ºC
  5. A continuación: a) Secar los cubres y guardarlos a 4ºC o b) rehidratarlos con PBS durante 10' a RT y comenzar la inmunofluorescencia

Histochoice

  1. Lavar los cubres con PBS
  2. Fijar las células con Histochoice (Sigma, Cole-Parmer) durante 5'-15' a RT
  3. Lavar las células con PBS (3x5')
  4. Alternativamente: tratar las células con 0.2-1% Tritón X-100 en PBS durante 10' a RT
  5. Lavar con PBS (3x5') y comenzar la inmunofluorescencia

Metanol

  1. Lavar los cubres con PBS
  2. Añadir Metanol a -20ºC muy lentamente sobre las células e incubar a -20ºC durante 15'
  3. Retirar el Metanol, rehidratar lavando con PBS (2x5') y comenzar la inmunofluorescencia a partir del paso 4

Metanol - Acetona, 80:20

  1. Lavar los cubres con PBS
  2. Añadir Metanol:Acetona a -20ºC muy lentamente sobre las células e incubar a -20ºC durante 15'
  3. Retirar el Metanol, rehidratar lavando con PBS (2x5') y comenzar la inmunofluorescencia a partir del paso 4

Metanol - Ac. Acético glacial

  1. Añadir a los cubres un volumen de metanol/acético (3:1) con un volumen de medio de cultivo. Incubar durante 5' a RT
  2. Lavar los cubres en solución fresca de metanol/acético (3:1) y fijar las células con una incubación de 10' en dicha solución
  3. Lavar con agua destilada (2x5') y a continuación con PBS (3x5'). Comenzar la inmunofluorescencia a partir del paso 4