Martes, 12 de Diciembre de 2017
    MICROSCOPÍA ÓPTICA Y CONFOCAL
 

Coordinador Científico:
Fco. Javier Díez-Guerra
Responsable Técnico:
Ángeles Muñoz

 

Microscopía Óptica y Confocal

 

SMOC

 

Comunidad de Madrid

 

ÚLTIMAS NOTICIAS

  • 07-12-2017: LSM510 Vertical reparado. Se ha cambiado el escáner X y el láser de Argón (línea 488).
  • 17-11-2017: Disponible de nuevo eescáner resonante del confocal Nikon A1R.
  • 16-11-2017: Apertura   confocal LSM800 a partir del lunes 20. Para realizar las reservas y organizar las sesiones de formación y asistencia, dirigirse al SMOC (lab 310).
  • 09-02-2017 Láser Maitai del Multifotón fuera de servicio. El equipo se puede utilizar como confocal.
 

ENLACES - PROTOCOLOS - INMUNOFLUORESCENCIA

 

ANTES DE NADA SE DEBERÍAN REALIZAR TRES TIPOS DE CONTROLES:

  1. AUTOFLUORESCENCIA, desarrollando el mismo protocolo pero sin anticuerpos primario y secundario,
  2. ANTICUERPOS SECUNDARIOS, incubando la muestra sólo con cada uno de los anticuerpos secundarios (ver también la página "Reactivos y fluoróforos/Anticuerpos")
  3. CRUCE O INTERFERENCIA DE CANALES, incubando con cada una de las combinaciones de anticuerpo primario y secundario por separado para recoger imágenes en todos los canales con los mismos parámetros de adquisición que los usados en las preparaciones dobles o triples,
  4. INCUBACIÓN SIMULTÁNEA FRENTE A LA SECUENCIAL. Aunque la incubación simultánea en un mismo paso con los anticuerpos primarios por un lado y los secundarios por otro es más rápida y cómoda, es preferible incubar secuencialmente primero con uno de los primarios y después con su secundario correspondiente. Así sucesivamente con todos los demás.

Inmunofluorescencia

  1. Eliminar la autofluorescencia mediante alguno de los métodos descritos
  2. Tratar los cubres durante 10' con PBS/0.1% Tritón X-100 a temperatura ambiente (RT)
  3. Incubarlos durante 10' con la solución de bloqueo (1-5 % BSA o 1-5 % suero fetal de ternera en PBS/0.1% Tritón X-100, o MAXblock™ Blocking Medium (Active Motif)) a RT
  4. Incubar las células durante 1h a RT con el anticuerpo primario diluído en la solución de bloqueo. Centrifugarlo previamente durante 5' a 12.000xg en la minifuga a 4ºC para eliminar agregados y reducir fondo
  5. Sumergir los cubres unas 3 veces en PBS para lavarlos
  6. Incubar las células durante 45' en oscuridad a RT con el anticuerpo secundario diluído en la solución de bloqueo. Centrifugarlo previamente durante 10' a 12.000xg en la minifuga a 4ºC. En el caso de usar faloidinas mejor incubar en PBS sin más
  7. Sumergir los cubres unas 3 veces en PBS para lavarlos
  8. Sumergir los cubres una vez en agua destilada y secar el exceso sobre papel
  9. Pasar los cubres brevemente por EtOH y secar el exceso sobre papel. Este paso no es estrictamente necesario
  10. Inmediatamente después montarlos sobre los portas

Montaje

  1. Depositar con la punta de un tip amarillo una gota de un medio de montaje sobre el porta
  2. A continuación colocar suavemente el cubre con las células boca-abajo sobre la gota de medio y presionar ligeramente con papel de filtro para que quede exclusivamente una fina capa de medio entre el porta y el cubre. En caso de preparaciones de gran grosor cuidado con esto último porque podéis alterar el volumen real de la muestra
  3. Dejar secar durante 24 horas a RT en oscuridad sobre papel de filtro. Puede secarse en estufa a 37ºC durante 3 ó 4 horas, pero mejor a RT
  4. Sellar los bordes con laca de uñas. Esto sólo si se van a guardar las preparaciones durante mucho tiempo
  5. Guardados a 4ºC en oscuridad pueden durar muchos meses. No guardar nunca la preparación a 4ºC antes de que esté realmente seca
  6. Sólo si lo consideráis necesario: montaje y sellado de los cubres con Twinsil (Picodent)