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Miércoles, 12 de Diciembre de 2018

Dinámica y función del genoma

         Reparación del DNA bacteriano

 


Grupo-400

 


Miguel de Vega

ECompogrupo

EListado

Resumen de investigación:

El mantenimiento de la estabilidad genómica depende en gran medida de la replicación fiel del DNA. Sin embargo, el daño continuo que sufren los genomas por agentes genotóxicos ha hecho necesario la emergencia de mecanismos de reparación que prevengan los efectos deletéreos que la permanencia de dichas lesiones podrían causar.

Nuestro principal objetivo es el estudio a nivel molecular de las proteínas responsables de la estabilidad genética en bacterias mediante el desarrollo de ensayos funcionales de proteínas de reparación de la bacteria modelo Bacillus subtilis, cuyas células vegetativas y esporas están expuestas a condiciones medioambientales extremas, causantes de múltiples daños en el DNA.

fig01.300px Modelo propuesto para explicar la coordinación entre las actividades polimerasa, AP-endonucleasa y 3´-5´ exonucleasa de PolXBs. (A) Movimiento del dominio PHP. Los residuos catalíticos del dominio PHP están coloreados en naranja. El nucleótido 3´ terminal de la cadena primer está representado como esferas en el centro activo de polimerización. La flecha curvada indica el movimiento propuesto del dominio PHP hacia la superficie superior (expuesta al solvente) del dominio de polimerización (formado por los subdominios thumb, palm, fingers y 8-kDa). Dicha rotación podría ser posible gracias al largo conector existente entre ambos dominios, que permitiría que el centro catalítico PHP, dispuesto en la superficie de este dominio, alcanzara y, o bien eliminara un extremo 3´ no elongable, o bien catalizara la hidrólisis en un sitio AP situado en el centro activo de polimerización, como se esquematiza en (B). Una vez que el dominio PHP regresa a su orientación inicial, el extremo 3´ resultante en ambos casos sería elongado mediante la inserción de un nucleótido por la actividad polimerasa. El modelo estructural de PolXBs fue proporcionado por el servidor SWISS-MODEL, utilizando la estructura cristalográfica del complejo ternario de ttPolX como molde (PDB code 3AUO).
 

Durante los últimos años hemos estudiado las funciones catalíticas de la DNA polimerasa de B. subtilis perteneciente a la familia X (PolXBs). Hemos mostrado como esta polimerasa posee, además de las características generales de esta familia de polimerasas, unas funciones nuevas, específicamente presentes en las PolXs bacterianas y de arqueas. Así, un dominio C-terminal presente en este grupo de proteínas y denominado PHP contiene los residuos catalíticos responsables de una actividad exonucleolítica que permite al enzima eliminar extremos desapareados durante la reparación de sustratos de DNA. Además, dicho dominio proporciona una nueva actividad AP-endonucleasa que capacita a estas DNA polimerasas a reconocer específicamente lesiones abásicas en el DNA y restaurar la informació﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽﷽nal en ausenciaar la informacista DNA polimerasa a reconocer especia polimerasa tienebientales extremas. la información genética original en una ruta que sería independiente de las AP endonucleasas celulares. Análisis bioquímicos de mutantes puntuales de la PolXBs junto con su modelado estructural utilizando como molde los datos estructurales de la PolX de Thermus thermophilus nos ha llevado a proponer un modelo que explica la coordinación adecuada de las diferentes actividades catalíticas de las PolXs bacterianas durante la reparación de sitios abásicos y de extremos 3´ desapareados por la ruta stremos 3raci they are not repaired in a timely fashion.(Figura 1).

Por otra parte estamos estudiando cómo la Ligasa D y el factor Ku de B.subtilis, proteínas centrales en la ruta de reparación NHEJ, llevan a cabo la reparación de las roturas del DNA, una de las lesiones más deletéreas ya que son letales para las células en división si no son reparadas.


Publicaciones  recientes:

  • Fernández-García, JL, de Ory, A, Brussaard, CPD, de Vega, M. (2017) Phaeocystis globosa virus DNA polymerase: a "Swiss Army knife", multifunctional DNA polymerase-lyase-ligase for base excision repair. Sci. Rep. 7:6907
  • Zafra O, Pérez de Ayala L, de Vega M. (2017) The anti/syn conformation of 8´-oxo-7,8-dihydro-2´-deoxyguanosine is modulated by Bacillus subtilis PolX active site residues His255 and Asn263. Efficient processing of damaged 3´-ends. DNA Repair 52: 59-69
  • de Ory A, Nagler K, Carrasco B, Raguse M, Zafra O, Moeller R, de Vega M. (2016) Identification of a conserved 5´-dRP lyase activity in bacterial DNA repair ligase D and its potential role in base excision repair. Nucleic Acids Res. 44(4): 1833-44
  • de Ory A, Zafra O, de Vega M. (2014) Efficient processing of abasic sites by bacterial nonhomologous end-joining ku proteins. Nucleic Acids Res. 42(21): 13082-95.
  • de Vega M. (2013) The minimal Bacillus subtilis nonhomologous end joining repair machinery. PLoS ONE 8(5): e64232.
  • Baños B, Villar L, Salas M, de Vega M. (2012) DNA stabilization at the Bacillus subtilis PolX core: a binding model to coordinate polymerase, AP-endonuclease and 3'-5' exonuclease activities. Nucleic Acids Res. 40(19):9750-62.

Patentes:

-Método para la replicación, amplificación o secuenciación de un ADN molde. Inventors: Margarita Salas Falgueras, Miguel de Vega José, José M. Lázaro Bolos, Luis Blanco Dávila, Mario Mencía Caballero. Owner:CSIC. Priority number: P200930412. Priority date: July 2, 2009. PCT/ES2010/070456 presented July 1, 2010. Licensed to XPol Biotech, S.L.

-Quimera de ADN polimerasa del fago ø29. Inventors: Margarita Salas Falgueras, Miguel de Vega José, José M. Lázaro Bolos, Luis Blanco Dávila, Mario Mencía Caballero. Owner: CSIC. Priority number: P200930413. Priority date: July 2, 2009. PCT/ES2010/070454 presented on July 1, 2010. Licensed to XPol Biotech, S.L.

-Método de amplificación de ADN basado en los orígenes de replicación del bacteriófago phi29 y secuencias nucleotídicas asociadas.Inventors: Margarita Salas Falgueras, Mario Mencía Caballero,Miguel de Vega José, Pablo Gella Montero, José M. Lázaro Bolos. Owner: CSIC. Priority number: P201130288. Priority date: March 3, 2011.         


Tesis doctorales:

Irene Rodríguez García (2006). La DNA polimerasa del bacteriófago ø29: Análisis mutacional de la interacción con la proteína terminal. Base estructural de la procesividad y la capacidad de desplazamiento de banda. Universidad Autónoma de Madrid.

Patricia Pérez Arnaiz (2008).Relación estructura-función en la DNA polimerasa del bacteriófago ø29. Papel del dominio intermedio de la proteína terminal en el reconocimineto específico de la DNA polimerasa. Universidad Autónoma de Madrid

Elisa Longás Torné (2008) Caracterización funcional de las DNA polimerasas de los bacteriófagos Nf y GA-1. Estudio del mecanismo de iniciación en la replicación con proteína terminal. Universidad Autónoma de Madrid.

Benito Baños Piñero (2011) Caracterización funcional de la DNA polimerasa X de Bacillus subtilis. Universidad Autónoma de Madrid (premio extraordinario).

Alicia del Prado Díaz (2015) Estudios estructurales y funcionales de la DNA polimerasa y la proteína terminal del bacteriófago ø29. Universidad Autónoma de Madrid.

Ana de Ory López (2016) Análisis bioquímico de las proteínas de reparación del DNA Ku y Ligasa D de Bacillus subtilis. Universidad Autónoma de Madrid.

 

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