Martes, 12 de Diciembre de 2017

Virología y microbiología

                Variabilidad genética de virus RNA

 

 grupo400

 


Esteban Domingo Solans

Bcompogrupo

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Resumen de Investigación:

Nuestro grupo fue pionero en el descubrimiento de las cuasiespecies víricas (1978-1990), una estructura poblacional altamente compleja y dinámica, con implicaciones en evolución y patogenia. Nuestros resultados de los últimos 40 años han sido ampliamente confirmados por la aplicación de secuenciación masiva llevada a cabo en muchos laboratorios durante los últimos tres años. El genoma de una población de virus RNA es un promedio ponderado de miríadas de secuencias distintas, estrechamente relacionadas entre sí que cambian constantemente. La secuencia consenso (o promedio) que escribimos por conveniencia, y que llena libros de texto y bases de datos, es una abstracción que ni tan siquiera puede que exista en la población que trata de representar. Las nubes de mutantes dinámicas están preparadas para responder a ambientes cambiantes mediante la selección de ciertas subpoblaciones de genomas preferentemente sobre otras.

La dinámica de cuasiespecies requiere nuevos abordajes para la prevención y el tratamiento de las enfermedades víricas asociadas a virus RNA, para contrarrestar la capacidad adaptativa conferida por los espectros de mutantes.

Estamos trabajando en el desarrollo de nuevas estrategias antivirales que eviten la selección de virus mutantes que escapen al tratamiento. El trabajo se está realizando principalmente con tres virus: el picornavirus virus de la fiebre aftosa (VFA), el arenavirus virus de la coriomeningitis linfocitaria de ratón (VCML) y más recientemente con el hepacivirus virus de la hepatitis C (VHC). Colaboramos con varios grupos para ampliar la perspectiva de nuestro trabajo: con Nuria Verdaguer (IBM, CSIC) en las alteraciones estructurales de la polimerasa vírica de mutantes de VFA resistentes a agentes mutagénicos; con Juan Carlos de la Torre (Scripps Research Institute, La Jolla) sobre mutagénesis letal de VCML; con  Pablo Gastaminza (CNB, CSIC), Josep Quer, Celia Perales (Hospital Vall d’Hebrón) y Aurora Sánchez (IIB, CSIC) en dinámica de HCV e interacciones hospedador-virus en cultivos celulares y en la clínica.

Durante los últimos años, nuestro énfasis ha sido en el VHC dada su   magnitud como problema de salud pública a nivel mundial y la directa implicación de su dinámica de cuasiespecies en enfermedad hepática y respuesta a tratamientos. Las principales contribuciones de nuestro grupo al VHC han sido: (i) la naturaleza multigénica de la resistencia a interferón; (ii) preparar poblaciones de VHC de distinto fitness para estudiar el efecto del fitness en la biología del VHC; (iii) que el fitness vírico es un determinante de multi-resistencia a drogas en ausencia de mutaciones específicas de resistencia; (iv) la ausencia de equilibrio poblacional (distribución estable de mutaciones y estasis fenotípica) incluso tras multiplicación prolongada del virus en un ambiente celular constante y (v) el diseño de tratamientos secuenciales y de combinación usando agentes antivirales mutagénicos y no-mutagénicos, con el objetivo de suprimir la infectividad (Figura 1). Estas investigaciones continúan actualmente.

La mutagénesis letal es un campo de investigación en expansión que ha abierto un nuevo capítulo de la farmacología antiviral. Nuestro trabajo, en colaboración con el lamentablemente ya fallecido John Holland (UCSD), proporcionó la primera evidencia experimental del efecto negativo del aumento de tasa de mutación provocado por mutagénesis química en la supervivencia de virus RNA (1990-1997). En nuestro cribado actual de nuevos agentes mutagénicos aceptados para uso en humanos, hemos demostrado que el agente antiviral de amplio espectro favipiravir (T-705) es mutagénico para VHC y el VFA y puede extinguir estos virus. Hemos colaborado con el grupo del Dr. Juan Carlos Saiz (INIA) para mostrar que favipiravir es mutagénico para el virus del Oeste del Nilo y que puede extinguir al virus. Seguimos incorporando nuevos agentes antivíricos mutagénicos y no mutagénicos de amplio espectro para nuestros diseños de terapias encaminadas a inhibir un amplio rango de virus RNA patógenos. Un problema crucial no resuelto es la integración de inhibidores mutagénicos y no-mutagénicos en diseños para combatir enfermedades asociadas a virus RNA.

Hemos descubierto un nuevo mecanismo de escape del VFA a mutagénesis letal por ribavirina y 5-fluorouracilo, consistente en la selección de mutantes víricos que pueden modular la incorporación de nucleótidos de manera que se evita el sesgo mutacional que a menudo producen los nucleótidos mutagénicos. Este mecanismo no modifica la amplitud del espectro de mutantes y su correspondiente flexibilidad adaptativa. Interesantemente, una mutación comodín (es decir, aquella que se repite cuando el virus se somete a presiones selectivas distintas) en la proteína no-estructural 2C moduló también la incorporación de nucleótidos como respuesta a la mutagénesis por ribavirina, en ausencia de mutaciones en la polimerasa vírica. Estas observaciones ponen de relieve los múltiples recursos adaptativos que tienen los virus RNA para responder a ambientes hostiles y justifican nuestros esfuerzos en busca de diseños antivirales para inhibir fuertemente la multiplicación de los virus.

Hemos continuado una colaboración con Susanna Manrubia (CNB, CSIC) que ha representado un vínculo altamente clarificador entre estudios teóricos y diseños experimentales. En una conexión interesante entre la expansión de los virus en la naturaleza y la evolución clonal de organismos, hemos propuesto para virus una distinción entre recombinación mecanísticamente activa pero inconsecuente y la recombinación evolutivamente relevante. Basado en la evidencia disponible, pensamos que mutación y recombinación ocurren continuamente durante la replicación de virus RNA pero que la mayoría de genomas mutantes y recombinantes no sobreviven (están sometidos a selección negativa). No obstante, hay subconjuntos de mutaciones que, en combinación con eventos puntuales de recombinación biológicamente relevante, contribuyen a la supervivencia de los virus y a su evolución (Figura 2). Estos estudios también están contribuyendo a un entendimiento más profundo de los acontecimientos a nivel molecular que subyacen a procesos de enfermedad vírica.

Nuestro objetivo principal es usar el nuevo entendimiento de dinámica viral que ha sido proporcionado por el marco de la teoría de cuasiespecies para encontrar nuevas maneras de inhibir la multiplicación viral. Es nuestra convicción que los nuevos diseños antivirales podrán aplicarse al control de virus patógenos ya establecidos así como a virus emergentes y re-emergentes (Figura 3).

 

figura 1

Figura 1: Resumen gráfico de nuestro trabajo reciente acerca de implicaciones de cuasiespecies y mutagénesis letal de virus RNA. El panel de la izquierda ilustra las olas mutacionales (identificadas mediante un color) de VHC cuantificadas mediante clonaje molecular-secuenciación Sanger y por secuenciación masiva, durante la multiplicación del virus en un ambiente biológico constante. Las ondas dibujadas se han identificado por los dos métodos, lo que excluye que se deban a un efecto de muestreo. Los paneles de la derecha ilustran la base conceptual de la mutagénesis letal con un ejemplo de extinción del VHC (arriba), un diseño de pases seriados (en medio) y extinción del VHC asociado a tratamiento con ribavirina (abajo). Información detallada está en las referencias indicadas y en la lista bibliográfica.

 

figura 2

Figura 2: Representación esquemática de la evolución clónica de virus. A partir de una infección inicial (Origin, abajo) se generan múltiples sub-linajes. La recombinación tiene lugar en cada rama (dobles flechas perpendiculares a las ramas). La diversificación biológicamente relevante se ilustra mediante ramas rojas y azules. Recombinación en un punto de discontinuidad (doble flecha grande vertical) es relevante biológicamente porque genera genomas mosaico con nuevos fenotipos. La evolución clónica continúa hasta que se alcanza un nuevo punto de discontinuidad. El esquema no implica una escala de espacio o tiempo. Reproducido de Perales et al. 2015, con permiso de la Academia Nacional de Ciencias de los EEUU.

 

figura 3

Figura 3: Un resumen del abordaje y objetivo principal de nuestra investigación.

 


 

Publicaciones relevantes (desde 2012) agrupadas por temas:

 

 

Implicaciones de cuasiespecies:

  • Domingo, E., Sheldon, J. and Perales, C. (2012). Viral quasispecies evolution. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 76, (2)159-216.
  • Andino, R. and Domingo, E. (2015). Viral quasispecies. Virology, 479-480: 46-51.
  • Domingo, E. Perales, C. (2016). Viral quasispecies and lethal mutagenesis. European Review, 24(1):39-48.
  • Domingo, E. Perales, C. (2016). Species Concepts: Viral quasispecies. In: Kliman, R.M. (ed.), Encyclopedia of Evolutionary Biology, vol.4, pp. 228-235. Oxford: Academic Press.
  • Domingo, E. (2016). Virus as Populations. Composition, complexity, dynamics and biological implications. Academic Press, Elsevier, Amsterdam.
  • Domingo, E., Schuster, P. (eds.) (2016). Quasispecies: From Theory to Experimental Systems.
  • Domingo, E., Schuster, P. (2016). What is a quasispecies? Historical origins and current scope.
  • Gregori, J., Perales, C., Rodríguez-Frías, F., Esteban, J.I., Quer, J., Domingo, E. (2016). Viral Quasispecies Complexity Measures. Virology 493: 227-237.
  • Domingo, E., de la Higuera, I., Moreno, E., de Ávila, A.I., Agudo, R., Arias, A., Perales, C. (2017). Quasispecies dynamics taught by natural and experimental evolution of foot-and-mouth disease virus. In: F. Sobrino and E. Domingo (Eds.). Foot-and-Mouth Disease Virus: Current Research and Emerging Trends, Horizon Scientific Press – Caister Academic Press, Poole, UK, pp. 147-170.
  • Moreno, E.; Gallego, I.; Gregori, J.; Lucia-Sanz, A.; Soria, M. E.; Castro, V.; Beach, N. M.; Manrubia, S.; Quer, J.; Esteban, J. I.; Rice, C. M.; Gomez, J.; Gastaminza, P.; Domingo, E.; Perales, C. (2017). Internal Disequilibria and Phenotypic Diversification during Replication of Hepatitis C Virus in a Noncoevolving Cellular Environment.

 Virus de la fiebre aftosa y polimerasa vírica:

  • Ferrer-Orta, C., de la Higuera, I., Caridi, F., Sanchez-Aparicio, M.T., Moreno, E. Perales, C., Singh, K., Sarafianos, S.G., Sobrino, F. Domingo, E., Verdaguer, N. (2015). Multifunctionality of a picornavirus polymerase domain: nuclear localization signal and nucleotide recognition.
  • Sobrino, F. and Domingo, E. (eds.) (2017). “Foot-and-Mouth Disease Virus: Current Research and Emerging Trends”, Horizon Scientific Press – Caister Academic Press, Poole, UK.

Interacciones VHC-hospedador:

  • Madejón, A., Sheldon, J., Francisco-Recuero, I., Perales, C., Dominguez-Beato, M., Lasa, M., Sanchez-Perez, I., Muntané, J., Domingo, E., Garcia-Samaniego, J., Sanchez-Pacheco, A. (2015). Hepatitis C virus-mediated Aurora B kinase inhibition modulates inflammatory pathway and viral infectivity. Journal of Hepatology, 63(2): 312-9.
  • Perez-del-Pulgar, S., Gregori, J., Rodriguez-Frias, F., Gonzalez, P., García-Cehic, D., Ramirez, S., Casillas, R., Domingo, E., Esteban, J. I., Forns, X., Quer, J. (2015). Quasispecies dynamics in hepatitis C liver transplant recipients receiving grafts from hepatitis C virus infected donors.
  • Valero, M.L., Sabariegos, R., Cimas, F., Perales, C., Domingo, E., Sánchez-Prieto, R., Mas, A. (2016). HCV RNA-dependent RNA polymerase interacts with Akt/PKB inducing its subcellular re-localization.

Resistencia a drogas:

  • Perales, C., Beach, N. M., Gallego, I., Soria, M. E., Quer, J., Esteban, J. I., Rice, C., Domingo, E., and Sheldon, J. (2013). Response of hepatitis C virus to long-term passage in the presence of interferon-α. Multiple mutations and a common phenotype. J. Virol., 87(13), 7593-7607.
  • Sheldon, J., Beach, NM., Moreno, E., Gallego, I., Piñeiro, D., Martínez-Salas, E., Gregori, J., Quer, J., Esteban, JI., Rice, CM., Domingo, E., Perales, C. (2014). Increased replicative fitness can lead to decreased drug sensitivity of hepatitis C virus.
  • Perales, C., Quer, J., Gregori, J., Esteban, J.I., Domingo, E. (2015). Resistance of hepatitis C virus to inhibitors: complexity and clinical implications. Viruses, 7:5746-5766.
  • Gallego, I., Sheldon, J., Moreno, E., Gregori, J., Quer, J., Esteban. J.I., Rice, C.M., Domingo, E., Perales, C. (2016). Barrier-Independent, Fitness-Associated Diferences in Sofosbuvir Efficacy against Hepatitis C virus.
  • Martín, V., Perales, C., Fernández-Algar, M., Dos Santos, HG., Garrido, P., Pernas, M., Parro, V., Moreno, M., García-Pérez, J., Alcamí, J., Torán, JL., Abia, D., Domingo, E., Briones, C. (2016). An Efficient Microarray-Based Genotyping Platform for the Identification of Drug-Resistance Mutations in Majority and Minority Subpopulations of HIV-1 Quasispecies. PLoS ONE, 11(12):e0166902.

Mutagénesis letal:

  • Ortega-Prieto, A.M., Sheldon, J., Grande-Pérez, A., Tejero, H., Gregori, J., Quer, J., Esteban, J.I., Domingo, E. and Perales, C. (2013). Extinction of hepatitis c virus by ribavirin in hepatoma cells involves lethal mutagenesis. PLoS ONE, 8(8): e71039.
  • Perales, C., Domingo, E. (2016). Antiviral strategies based on lethal mutagenesis and error threshold. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 392:323-339.
  • Agudo, R., de la Higuera, I., Arias, A., Grande-Perez, A., Domingo, E. (2016). Involvement of a joker mutation in a polymerase-independent lethal mutagenesis escape mechanism. Virology 494:257-266.
  • De Ávila, A.I., Gallego, I., Soria, M.E., Gregori, J., Quer, J., Esteban, J.I., Rice, C.M., Domingo, E., Perales, C. (2016). Lethal mutagenesis of hepatitis C virus induced by favipiravir. PLoS ONE, 11 (10): e0164691.
  • de Ávila, A. I.; Moreno, E.; Perales, C.; Domingo, E. (2017). Favipiravir can evoke lethal mutagenesis and extinction of foot-and-mouth disease virus. Virus Res., 233, 105-112.
  • de la Higuera, I.; Ferrer-Orta, C.; de Avila, A. I.; Perales, C.; Sierra, M.; Singh, K.; Sarafianos, S. G.; Dehouck, Y.; Bastolla, U.; Verdaguer, N.; Domingo, E. (2017). Molecular and Functional Bases of Selection against a Mutation Bias in an RNA Virus. Genome Biol. Evol., 9 (5), 1212-1228.
  • Escribano-Romero, E., Jiménez de Oya, N., Domingo, E., Saiz, J.C. (2017). Extinction of West Nile virus by favipiravir through lethal mutagenesis.

Evolución general de virus:

  • Perales, C. Moreno, E. Domingo, E. (2015). Clonality and intracellular polyploidy in virus evolution and pathogenesis. Proc Natl Acad Sci USA, 112(29):8887-92.

 


 

Patentes:

  • N. Sevilla, E. Domingo, C. Escarmís, S. Ojosnegros, J. García-Arriaza, M. Sanz-Rojo, T. Rodríguez. "Vacuna atenuada para la fiebre aftosa". Nº DE SOLICITUD: P200801583. Patente concedida en España el 16/06/2011. Nº PUB: ES2344875.

 


 

Tesis doctorales:

  • Héctor Moreno Borrego (2012).  Dinámica poblacional del virus de la coriomeningitis linfocitaria del ratón en su interacción con agentes mutagénicos. Universidad Autónoma de Madrid. Directores: Esteban Domingo y Verónica Martín.
  • Ignacio de la Higuera Hernández (2014). Factores determinantes del reconocimiento de nucleótidos en el virus de la fiebre aftosa. Universidad Autónoma de Madrid. Director: Esteban Domingo.
  • Ana Mª Ortega Prieto (2014). Mutagénesis letal del virus de la Hepatitis C. Universidad Autónoma de Madrid. Directores: Esteban Domingo y Celia Perales.
  • Elena Moreno del Olmo (2017). Evolución a largo plazo de virus RNA en ambiente biológico constante. Universidad Autónoma de Madrid. Directores: Esteban Domingo y Celia Perales.

 


 

Otras actividades:

  • Académico Numerario de la Real Academia de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales, adscrito a la Sección de Ciencias Naturales, (2011).
  • Miembro de la Red Española de Biofísica, coordinada por el Dr. David Reguera, desde 2011.
  • Miembro del Global Virology Network, coordinado por el Dr. Robert Gallo, desde 2011.
  • Miembro del Comité Organizador del Congreso FEMS 2011 (Ginebra, Suiza, 2011).
  • Editor asociado de la revista Virus Research desde 2012.