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Viernes, 6 de Diciembre de 2019

Biotecnología y genética de bacterias termófilas extremas

 grupo400

 


José Berenguer Carlos

Bcompogrupo

Blistado

 

Resumen de la Investigación:

El objetivo principal de nuestro grupo se centra en el uso de termófilos como modelos biológicos y como herramientas y fuente de enzimas termoestables (termozimas) para biotecnología. Nuestro organismo modelo es Thermus thermophilus (Tth), una bacteria termófila de origen filogenético ancestral que muestra un rápido crecimiento bajo condiciones de laboratorio así como un aparato de competencia natural altamente eficiente (ACN).

 

figura 1

Figura 1: ADN extracelular que entra en Thermus thermophilus a través del aparato de competencia natural enfrenta su degradación por ThAgo a través de la interferencia de gADN-ADN. Por el contrario, el dsDNA transferido por una célula Tth de un donante a través de la translocasa TdtA e incorporado a través del ACN no es susceptible a ThAgo. La ADN helicasa HepA también se requiere en el donante, que probablemente repare las cicatrices generadas en el genoma en el proceso de donación casi aleatorio.

 

Como modelos biológicos, hemos centrado nuestra atención en el mecanismo de transferencia horizontal de genes (THG) entre las cepas Tth que requiere contactos de célula a célula y depende de un ACN activo en la célula receptora. El mecanismo, denominado transjugación, también necesita la presencia en la célula donadora de una translocasa de ADN (TdtA) codificada junto con un sistema de restricción y una nucleasa en un operón que pertenece a un pequeño elemento conjugativo e integrativo (ICEth1), cuyo mecanismo de transferencia está actualmente en estudio. Otro punto de atención en estos estudios de biología básica es el papel como barrera contra el HGT desempeñado por un homólogo del Argonauta humano (ThAgo). Sabemos que el ThAgo inhibe la entrada de ADN extracelular a través del ACN por un mecanismo de interferencia ADN-ADN. Como esta acción de barrera de ThAgo se omite cuando el ADN se transfiere mediante transjugación, se ha planteado la hipótesis de un mecanismo de activación/desactivación que también es el tema de nuestra investigación actual. En este contexto, TthAgo parece distinguir entre el ADN ambiental potencialmente peligroso del ADN "confiable" obtenido de una cepa relacionada. Además, como la interferencia de los ácidos nucleicos constituye la base para la edición del gen, estamos trabajando en el uso de éste y otros Ago procarióticos para este fin.

 

figura 2

Figura 2: Uso de microgotas en cribados de ultra-alto rendimiento. A) Crecimiento de microorganismos y células de mamíferos. B) Cribado de termozimas recombinantes expresadas en T. thermophilus. C) Expresión in vitro de termozimas utilizando la transcripción/traducción in vitro derivada de T. thermophilus. D) PCR digital para detectar microorganismos raros (materia biológica oscura) y genes. Crédito de las figuras: M. Almendros, A. Lopes y M. Sánchez.

 

Nuestra investigación también está centrada en el descubrimiento de termozimas y variantes termoestables de enzimas que puedan responder mejor a los requisitos de la biocatálisis industrial. Para esto, hemos utilizado Tth como anfitrión para la selección in vivo de enzimas termoestables en grandes librerías génicas utilizando herramientas y cepas desarrolladas recientemente. En paralelo, hemos incorporado a nuestro laboratorio métodos de cribado de ultra-alto rendimiento basados en el uso de emulsiones de agua en aceite o microgotas. La reducción del tubo de ensayo a un compartimiento de picolitros permite realizar hasta 106 ensayos enzimáticos al día y allana el camino para futuros experimentos de biología de una sola célula. Las microgotas que contienen la librería metagenómica se generan utilizando microchips de silicona de fabricación propia, para a continuación proceder a su cribado mediante microchips específicos utilizando un sorter diseñado a medida.

 


 

Artículos seleccionados:

  • Mate DM, Rivera NR, Sanchez-Freire E, Ayala JA, Berenguer J y Hidalgo A (2019) Thermostability enhancement of the Pseudomonas fluorescens esterase I by in vivo folding selection in Thermus thermophilus. Biotech. Bioeng. doi: 10.1002/bit.27170
  • Verdú C, Sanchez-Freire E, Ortega C, Hidalgo A, Berenguer J* y Mencía M* (2019) A modular vector toolkit with a tailored set of thermosensors to regulate gene expression in Thermus thermophilus. ACS Omegadoi: 10.1021/acsomega.9b02107
  • Alvarez L, Sanchez-Hevia D, Sánchez M y Berenguer J (2018) A new family of nitrate/nitrite transporters involved in denitrification. Int. Microbiol. 22, 19–28. doi: 10.1007/s10123-018-0023-0
  • Chahlafi Z, Alvarez L, Cava F y Berenguer J (2018) The role of conserved proteins DrpA and DrpB in nitrate respiration of Thermus thermophilus. Environ. Microbiol. 20, 3851- 3861. doi: 10.1111/1462-2920.14400
  • Antonucci I, Gallo G, Limauro D, Contursi P, Ribeiro AL, Blesa A, Berenguer J, Bartolucci S y Fiorentino G. (2018) Characterization of a promiscuous cadmium and arsenic resistance mechanisms in Thermus thermophilus HB27 and potential application of a novel bioreporter system. Microb. Cell Fact. 17, 78- 87. doi: 10.1186/s12934-018-0918-7
  • Blesa A, Averhoff B y Berenguer J (2018) Horizontal gene transfer in Thermus sp. Curr. Issues Mol. Biol. 29, 23-36. doi: 10.21775/cimb.029.023
  • Consolati T, Bolívar JM, Petrasek Z, Berenguer J, Hidalgo A, Guisán JM y Nidetzky B. (2018) Bio-based pH internally sensitive materials: immobilized yellow fluorescent protein as optical sensor for spatiotemporal mapping of pH inside porous matrices. ACS Appl. Mater. Interfaces 10, 6858-6868. doi:10.1021/acsami.7b16639
  • Antonucci I, Gallo G, Limauro D, Contursi P, Ribeiro AL, Blesa A, Berenguer J, Bartolucci S y Fiorentino G. (2017) An ArsR/SmtB family member regulates arsenic resistance genes unusually arranged in Thermus thermophilus HB27. Microb. Biotechnol. 10, 1690-1701. doi: 10.1111/1751-7915.12761
  • Alvarez L, García-Quintáns N, Blesa A, Baquedano I, Bricio C, Mencía M y Berenguer J (2017) Hierarchical control of nitrite respiration by transcription factors encoded within mobile gene clusters of Thermus thermophilus. Genes 8, 361. doi:10.3390/genes812036
  • Ribeiro AL, Sánchez M, Hidalgo A y Berenguer J (2017) Stabilization of enzymes by using thermophiles. Methods Mol. Biol. 1465, 297-312. doi: 10.1007/978-1-4939-7183-1_21
  • Blesa A, Quintáns NG, Baquedano I, Mata CP, Castón JR y Berenguer J (2017) Role of archaeal HerA protein in the biology of the bacterium Thermus thermophilus. Genes 8, 130. doi:10.3390/genes8050130
  • Blesa A, Baquedano I, García-Quintáns N, Mata CP, Castón JR and Berenguer J (2017) The transjugation machinery of Thermus thermophilus: Identification of TdtA, an ATPase involved in DNA donation. PloS Genetics 13, e1006669. doi: 10.1371/journal.pgen.1006669
  • Berenguer J, Mencía M and Hidalgo A. (2017) Are in vivo selections on the path to extinction? Microb. Biotechnol. 10, 46-49. doi: 10.1111/1751-7915.12490
  • Swarts DC, Hegge JW, Hinojo I, Shiimori M, Ellis MA, Dumrongkulraksa J, Terns RM, Terns MP y van der Oost J (2015) Argonaute of the archaeon Pyrococcus furiosus is a DNA-guided nuclease that targets cognate DNA. Nucleic Acids Res. 43, 5120-5129. doi: 10.1093/nar/gkv415

 


 

Últimas Tesis Doctorales:

  • Alba Blesa Esteban (2016) Horizontal gene transfer in Thermus thermophilus: mechanisms and barriers. Universidad Autónoma de Madrid. Director: José Berenguer.
  • Yamal Al-ramahi González (2013) Ingeniería de proteínas fluorescentes y aplicaciones de localización celular en microorganismos termófilos. Universidad Autónoma de Madrid. Directores: José Berenguer y Aurelio Hidalgo.
  • Noé R. Rivera (2013) Termoestabilización de proteínas de interés biológico. Universidad Autónoma de Madrid. Directores: José Berenguer y Aurelio Hidalgo.
  • Laura Alvárez Múñoz (2012) Análisis de la respiración de nitrito en Thermus thermophilus. Universidad Autónoma de Madrid. Director: José Berenguer.

 


 

Proyectos Internacionales y Redes de Excelencia:

  • METAFLUIDICS: Advanced toolbox for rapid and cost-effective functional metagenomic screening: microbiology meets microfluidics. Entidad financiadora: Unión Europea H2020. GA 685474. Período: 01/06/2016-30/05/2020. Tipo de participación: Coordinación (Aurelio Hidalgo).
  • CARBAZYMES: Sustainable industrial processes based on a C-C bond-forming enzyme platform. Entidad financiadora: Unión Europea H2020. GA 635595. Período: 01/04/2015-31/03/2019. Tipo de participación: Socio.
  • RedEx: Red Nacional de Microorganismos Extremófilos. Redes de Excelencia. BIO2015-71815. Período: 01/01/2016-30/06/2018. Tipo de participación: Socio.
  • HOTDROPS: Ultrahigh-throughput platform for the screening of thermostable proteins by thermophilic in vitro transcription-translation and microfluidics. Entidad financiadora: Unión Europea FP7. GA 324439. Período: 01/06/2013-30/05/2017. Tipo de participación: Coordinación (José Berenguer).

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