Jueves, 14 de Diciembre de 2017
    CITOMETRÍA DE FLUJO
 

Coordinadora Científica:
María Luisa Toribio
Responsable Servicio:
Berta Raposo

 

Citometría de Flujo

 

Principios y Aplicaciones

La citometría de flujo es una herramienta de análisis que permite discriminar partículas de diferente tamaño y color. Esta técnica de análisis es utilizada de forma rutinaria en muchos laboratorios clínicos y de investigación para medir y cuantificar propiedades fenotípicas, bioquímicas y/o moleculares de células individualizadas mediante la utilización de sondas fluorescentes específicas de uno o varios parámetros celulares.

La principal característica de la citometría es que puede ofrecer de forma muy rápida información simultánea de varios parámetros de cada una de las partículas analizadas, así como la relación entre dichos parámetros. Los parámetros analizables por citometría de flujo son: i) los relacionados con las características físicas de la partícula: el tamaño y la complejidad y ii) las distintas fluorescencias asociadas a la partícula. El análisis se realiza a velocidades de miles de células/segundo, lo que permite obtener datos de elevada fiabilidad estadística, así como identificar poblaciones representadas en baja frecuencia dentro de la población global. Otra importante característica de la citometría de flujo es que el análisis se realiza en una suspensión de partículas individualizadas, por lo que las partículas o células objeto de análisis deben encontrarse en suspensión y en forma de partícula (célula) única. Finalmente, es importante destacar que existe una restricción respecto al tamaño de las partículas objeto de análisis, ya que estas deben tener tamaños comprendidos entre las 0.5-100um.

Representación de datos

La información obtenida por técnicas de análisis de citometría de flujo se representa en forma distribuciones de frecuencia o histogramas de una o dos dimensiones. En los histogramas de una dimensión o parámetro se representa el número de células o partículas (en el eje de ordenadas) frente a la intensidad de fluorescencia de un parámetro (en el eje de abcisas) (figura A). Las distribuciones de frecuencia de dos parámetros, también denominadas citogramas, representan en cada eje la intensidad de fluorescencia de un parámetro diferente. Las más comunes son las distribuciones de frecuencia de puntos (“dot plots”) donde cada punto representa a una partícula analizada, y la distribución de los puntos permite visualizar las contribuciones relativas de cada región de rangos de intensidad de fluorescencia. También se utilizan distribuciones de frecuencia o de densidad de dos dimensiones en los que la proporción de las células en cada región se definen por una escala de color o por gradientes de curvas de contorno. La utilización de representaciones en dos dimensiones permite establecer de manera visual cual es la correlación entre cualesquiera dos parámetros (figura B). Otra característica propia del análisis de datos de citometría de flujo es la utilización de ventanas de análisis (“gates”) (figura C). El establecimiento de ventanas de análisis se utiliza tanto para seleccionar de manera específica la población de células o partículas de interés, normalmente en base a los parámetros de dispersión frontal y ortogonal de la luz, como para simplificar el análisis de poblaciones heterogéneas en las que se analizan simultáneamente un número elevado de parámetros.

Cell Sorting

Aplicaciones comunes de la citometría de flujo:

  • Inmunofenotipo
  • Análisis del ciclo celular
  • Genes reporteros
  • Medida de la proliferación celular
  • Apoptosis
  • Flujo de calcio
  • Señalización intracelular: detección de fosfoproteínas a nivel unicelular
  • Ensayos Multiplexado de moléculas en disolución

Protocolos

Tinción de proteínas de membrana

Protocolo de tinción de membrana con anticuerpos conjugados con fluorocromos.

  1. Poner unas 500,000 células en un pocillo de p96 o tubo eppendorf y centrifugar (1000 rpm 5'). Eliminar el sobrenadante (SN)
  2. Lavar el pellet con PBS-staining: centrifugar (1000 rpm 5'). Eliminar SN
  3. Incubar con la combinación de anticuerpos marcados con fluorocromos en un volumen final de 50ul: 20' a 4ºCen oscuridad
  4. Lavar el pellet con PBS-staining : centrifugar (1000 rpm 5'). Eliminar SN
  5. Resuspender en 500ul de PBS-staining y poner en un tubos de citómetro (proteger de la luz y mantener en frío)
  6. Analizar muestras en citómetro de flujo

Protocolo de tinción de membrana con anticuerpos primarios no marcados y revelados con anticuerpos secundarios conjugados con fluorocromos para análisis por citometría de flujo

  1. Poner unas 500,000 células en un pocillo de p96 o tubo eppendorf y centrifugar (1000 rpm 5'). Eliminar SN
  2. Lavar el pellet con PBS-staining: centrifugar (1000 rpm 5'). Eliminar SN
  3. Incubar con el anticuerpo primario (en un volumen final 50ul con PBS-staining ): 20' a 4ºCen oscuridad
  4. Lavar el pellet con PBS-staining: centrifugar (1000 rpm 5'). Eliminar SN
  5. Incubar con el anticuerpo secundario marcado (en un volumen final de 50ul con PBS-staining): 20' a 4ºCen oscuridad
  6. Lavar el pellet con PBS-staining: centrifugar (1000 rpm 5'). Eliminar SN

a) Tinción con un solo fluorocromo:

  1. Resuspender en 500ul de PBS-staining y poner en un tubo de citómetro (proteger de la luz y mantener en frío)
  2. Analizar muestras en citómetro de flujo

b) Tinción simultánea con otros anticuerpos marcados directamente con fluorocromos:

  1. Bloquear los sitios Fab libres del anticuerpo secundario unido a la célula incubando con suero preinmune o anticuerpo purificado no marcado de la misma especie que el anticuerpo primario no marcado: incubar con 10ul suero preinmune diluido 1/10 en PBS-staining
  2. Lavar el pellet con PBS-staining: centrifugar (1000 rpm 5'). Eliminar SN
  3. Incubar con anticuerpos marcados con fluorocromo (en un volumen final de 50ul con PBS-staining): 20' a 4ºCen oscuridad
  4. Lavar el pellet con PBS-staining: centrifugar (1000rpm 5'). Eliminar SN
  5. Resuspender en 500ul de PBS-staining y poner en un tubo de citómetro (proteger de la luz y mantener en frío)
  6. Analizar muestras en citómetro de flujo

PBS-Staining
PBS1x
1%BSA
0,01% NaN3
1%FCS
(utilizar a 4ºC)

Tinción simultánea de proteínas intracelulares y de membrana

Tinción de membrana:

  1. Poner 1-2x106 células en un pocillo de p96 o tubo eppendorf y centrifugar (1000 rpm 5'). Eliminar el sobrenadantes (SN)
  2. Lavar el pellet con 200ul de PBS-staining: centrifugar (1000 rpm 5'). Eliminar SN
  3. Incubar con la combinación de anticuerpos frente a moléculas de membrana marcados con fluorocromos en un volumen final de 50ul: 20' a 4ºC en oscuridad
  4. Lavar el pellet con 150ul de PBS-staining: centrifugar (1000 rpm 5'). Eliminar SN

Fijación:

  1. Resuspender en 200ul de tampón de fijación: 30' a 4ºC en oscuridad
  2. Lavar el pellet con 150ul de PBS-staining: centrifugar (1000 rpm 5'). Eliminar SN

Permeabilización y tinción intracelular:

  1. Resuspender en 200ul de PBS-staining + 0,2% saponina + suero de la especie de las células que se marcan (50% suero humano inactivado por calor o 20% suero preinmune de ratón): 15' a RT en oscuridad
  2. Centrifugar, eliminar SN y añadir la combinación de anticuerpos frente a moléculas intracelulares marcados con fluorocromos en un volumen final de 50ul de PBS-staining + 0,2% saponina: 20' a 4ºC en oscuridad
  3. Lavar el pellet con 150ul de PBS-staining + 0,2% saponina: centrifugar (1000 rpm 5'). Eliminar SN
  4. Resuspender en 500ul de PBS-staining + 0,2% saponina y poner en tubos de citómetro (protegido de la luz)
  5. Analizar las muestras en el citómetro

PBS-Staining
PBS1x
1%BSA
0,01% NaN3
1%FCS
(utilizar a 4ºC)

Tampón de fijación
PBS1x
2% paraformaldehido
pH 7.2

Análisis de Ciclo Celular con Ioduro de Propidio

  1. Recoger las células que se van a analizar poniendo el mismo número de células (aproximadamente 1-3 millones de células) en todas las muestras
  2. "Pelletear" las células de la manera habitual. Retirar el sobrenadante sin alterar el pellet.
  3. Resuspender las células en el volumen residual
  4. Añadir gota a gota 1 ml de etanol 70% frío mientras se vortea suavemente
  5. Las muestras pueden permanecer en etanol varios meses a -20ºC, y se aconseja no marcarlas con IP hasta que hayan transcurrido al menos 18 horas de fijación con etanol
  6. Opcional: añadir PBS antes de centrifugar para diluir el etanol incrementando así la eficiencia de la centrifugación
  7. Centrifugar 5' a 1500 g
  8. Eliminar el sobrenadante, resuspender de nuevo en 1 ml de PBS y (5´ 400 g)
  9. Repetir el paso 8
  10. Resuspender en el volumen residual el pellet y añadir 0,5 ml de tampón de ciclo
  11. Dejar marcando las células durante 30' a temperatura ambiente en oscuridad
  12. Analizar las muestras en el citómetro de flujo en menos de 24 horas

Tampón de ciclo: PI/RNase Staining Buffer (BD Pharmingen 550825)

 

Adquisición en FacsCalibur
Información técnica sobre los fundamentos del análisis del ciclo celular por CF
Revisión sobre los diferentes colorantes para el análisis del ciclo celular

Análisis de Ciclo Celular con DAPI

Material necesario
DAPI Calbiochem 268298
Staining buffer (SB) 100mM tris (pH 7,4)
150 mM de NaCl
1mM CaCl2
0,5 mM MgCl2
0,1% Nonidet P40
3µM DAPI

Procedimiento:

  1. Recoger las células que se van a analizar poniendo el mismo número de células (aproximadamente 1-3 millones de células) en todas las muestras
  2. "Pelletear" las células de la manera habitual. Retirar el sobrenadante sin alterar el pellet
  3. Mezclar de forma vigorosa (disgregar el pellet en el volumen residual) y añadir gota a gota 1 ml de etanol 70% frío
  4. Resuspender las células en el volumen residual
  5. Añadir gota a gota 1 ml de etanol 70% frío mientras se vortea suavemente
  6. Las muestras pueden permanecer en etanol varios meses a -20ºC, y no deben marcarse con DAPI hasta que hayan transcurrido al menos 18 horas de fijación con etanol
  7. Opcional: añadir PBS antes de centrifugar para diluir el etanol incrementando así la eficiencia de la centrifugación
  8. Centrifugar 5' a 1500 g
  9. Eliminar el sobrenadante, resuspender de nuevo en 1 ml de PBS y (5´ 400 g)
  10. Repetir el paso 8
  11. Resuspender en el volumen residual el pellet y añadir 0,5ml de SB
  12. Dejar marcando las células durante 30' a temperatura ambiente en oscuridad
  13. Analizar las muestras en el citómetro de flujo en menos de 24 horas
  14. Analizar las muestras en el citómetro de flujo en menos de 24h. Filtrar y analizar en el FACSCanto FL7 con el filtro BP450/50

Ciclo celular en células sin fijar (Vybrant DyeCycleTM Orange Stain)*

  1. Cultivar las células en las condiciones a estudiar
  2. Una vez finalizado el tratamiento recoger y contar las células
  3. Lavarlas con PBS atemperado
  4. Realizar el marcaje en superficie deseado
  5. Resuspender 0.5x106 células en 0.5 ml de PBS 1X 2% FCS
  6. Añadir 4 ul (para 0.5 ml de suspensión celular) de Orange Stain e incubar 1 h a Tª ambiente*

*Condiciones testadas en células Jurkat en otros tipos celulares el tiempo, concentración del colorante y la temperatura de incubación pueden verse modificadas (ver información del proveedor)

Materiales
Células Jurkat
Vybrant DyeCycleTM Orange Stain (Molecular Probes V35005)
PBS 1X 2% FCS (Foetal Calf Serum)

Discriminación de células vivas y muertas por tinción con DAPI

  1. Añadir a la muestra DAPI* a una concentración final de 0,2 µg/ml en el momento de analizarlas

*Merck Ref 268298 Stock 5 µg/ul (etanol) Máximo de excitación 359 nm Máximo de emisión 461 nm

Consideraciones

  • Analizar las muestras en el citómetro lo antes posible
  • Es necesario analizar las muestras en un equipo dotado de láser UV o Violeta*
  • En el caso del FACSCanto II la señal emitida se recogerá en el detector FL7 con el filtro 450

Viabilidad con Ioduro de Propidio

  1. Marcar las células en membrana siguiendo el protocolo de tinción requerido
  2. Resuspender en 500ul de PBS-staining y poner en un tubo de citómetro
  3. Añadir yoduro de propidio (IP) a 1 ug/ml concentración final. Proteger los tubos de la luz
  4. Analizar las muestras en el citómetro inmediatamente, la tinción es instantánea

PBS-Staining
PBS1x
1%BSA
0,01% NaN3 1%FCS

Movilización de calcio con indo 1 AM (adaptado del current protocols in cytometry)

  1. Recoger las células y centrifugarlas a 200g a temperatura ambiente
  2. Resuspender a una concentración 106-107 células/ml en HBSS suplementado (1)
  3. Añadir el volumen necesario del stock A de INDO 1 AM (2) sin plurónico a la suspensión celular para obtener 2µg/ml de concentración final o alternativamente añadir de 5 a 8 µl del stock de INDO 1 AM con plurónico**
  4. Incubar a 30ºC durante 30 minutos, protegido de la luz y en agitación***
  5. Centrifugar las células a 200g a temperatura ambiente y resuspender las células en HBSS suplementado a una concentración de 1 a 3x106 células/ml
  6. Dejar las células a temperatura ambiente protegidas de la luz durante 15 min
  7. Preatemperar 5 min las células a 37ºC
  8. Analizar en el FACSVantage con el set de filtros adecuado (pedir cita con el Servicio de Citometría)
  9. Comprobar la tinción y el grado de respuesta de las células añadiendo de 4 µM final del ionóforo A23187 (3) (Sigma C7522) (el 100% de las células han de responder)

* Opcionalmente añadir Probenecid (4mM final). Minimiza la salida del INDO 1 AM y las variaciones de carga célula-célula

** La adición de plurónico F-127 junto con el INDO 1 AM puede mejorar la tinción de las células (mayor uniformidad). En este punto puede realizarse la tinción con marcadores de superfície, libres de azida y debidamente titulados (en caso de modulación del antígeno utilizar PE en lugar de FITC, puede ser detectado después de internalizado, e incubar a 4ºC después de la tinción con INDO 1 AM)

*** Las condiciones óptimas para cada tipo celular pueden diferir de las aquí citadas

(1) HBSS suplementado con:
1 mM de Ca2+
1mM de Mg2+
1% de FBS (inactivado) ó 0.5% de BSA

(2) Preparación stock INDO 1 AM (Molecular Probes I1223)
Resuspender 1 alícuota de 50 µg de INDO 1 AM en 25 µl de DMSO (2mg/ml)
Guardar en nevera protegida de la luz hasta su uso, usar antes de tres meses una vez resuspendida
Resuspender 1 alícuota de 50 µg de INDO 1 AM en 25 µl de plurónico F-127 al 20% en DMSO y 113 µl de FBS

(3) Ionóforo A23187 (Sigma C7522)
Alícuotas de 10ml (2mM en H2O)

Movilización de calcio con fluo-3AM/fura red AM (adaptado del current protocols in cytometry)

  • Recoger las células y centrifugarlas a 200g a temperatura ambiente
  • Resuspender a una concentración 106-107 células/ml en PBS
  • Centrifugar a 200g y resuspender en HBSS suplementado(1)
  • Añadir el volumen necesario del stock de FuraRed(2) a la suspensión celular para obtener 10 µM de concentración final y del stock de Fluo3 para obtener una concentración final de 4 µM
  • Incubar a 37ºC durante 30 minutos, protegido de la luz y en agitación**
  • Centrifugar las células a 200g a temperatura ambiente y lavar dos veces con HBSS suplementado
  • Resuspender las células en HBSS suplementado a una concentración de 106 células/ml
  • Dejar las células a temperatura ambiente protegidas de la luz durante 15 min
  • Preatemperar 5 min las células a 37ºC
  • Analizar en el FACS Canto durante a 300-500 eventos/segundo durante 1 minuto para establecer el nivel basal
  • Detener la adquisición, añadir el estímulo pertinente y continuar la adquisición el tiempo necesario. En función del estímulo el tiempo de adquisición de muestra puede variar
  • Comprobar la tinción y el grado de respuesta de las células añadiendo un ionóforo (el 100% de las células han de responder inmediatamente tras la adición del mismo)

**Las condiciones óptimas para cada tipo celular pueden diferir de las aquí citadas tanto en concentración como en tiempo de incubación

(1) HBSS suplementado con:
1 mM de Ca2+
1 mM de Mg2+
1% de FBS (inactivado) ó 0.5% de BSA

(2) Preparación stock Fura Red
Resuspender 1 alícuota de 50 µg de Fura Red en 50 µl de DMSO (1µg/µl)
Guardar en nevera protegida de la luz hasta su uso, usar antes de tres meses una vez resuspendida

(3) Preparación stock Fluo 3
Resuspender 1 alícuota de 50 µg de Fluo 3 en 50 µl de DMSO (1µg/µl)
Guardar en nevera protegida de la luz hasta su uso, usar antes de tres meses una vez resuspendida

FIGURA Células jurkat estimuladas durante 2 minutos con anti CD3 (OKT3 150 ng/ml) y posteriormente durante 1 minuto con 4 µM del ionóforo A23187 (Sigma C7522)
  Star t End t Peak t Peak Mean Y Slope
Basal 0 60.25 22 15.63 13.46 0.074
OKT 59.63 240.98 241 64.98 32.92 0.113
Ionoforo 240.98 300 281 98.68 95.62 0.181

Determinación de células apoptóticas mediante tinción de Annexina V y 7AAD

  1. Lavar las células dos veces con PBS frío y resuspender en tampón de unión de annexina (1X) a una concentración de 1x106 células/ml
  2. Transferir 100 µl (100.000 células) de la suspensión a tubos de citometría
  3. Añadir 2,5 ul de Annexina V PE y 5 ul de 7AAD por tubo*
  4. Mezclar e incubar 15 min a temperatura ambiente protegido de la luz
  5. Añadir 400 µl de tampón 1x y analizar antes de 1h

*Controles: Poner un tubo de células sin teñir, otro con células y 7AAD solo y otro con células y Annexina V PE solo (células tratadas con un estímulo apoptótico, imagen correspondiente a células Jurkat tratadas con staurosporina 2,5 µM durante 2h)

Material requerido
Ø PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I (Servicio de Citometría BD PharmingenTM 559763) incluye tampón de unión, Annexina V y 7AAD

Protocolo de tinción con HOESCHT 33342 para la tinción de células madre*

  1. Poner un baño a 37ºC EXACTAMENTE y asegurarse que estará a esta temperatura durante todo el proceso de tinción. Preatemperar el DMEM+ durante el proceso de extracción de las médulas
  2. Contar las células y resuspenderlas a 106 células por ml en DMEM+ preatemperado
  3. Añadir HOESCHT33342 a una concentración final de 5 µg/ml
  4. Mezclar bien la suspensión celular e incubarla en un baño de agua a 37ºC durante 90 min EXACTAMENTE. Asegurarse que los tubos están bien sumergidos en el agua del baño para garantizar la temperatura uniforme y constante de la suspensión. Agitar los tubos varias veces durante la incubación
  5. Centrifugar las células en FRÍO durante 10 minutos a 1200 rpm y resuspender en HBSS+ frío
  6. Opcional: Teñir las células con marcadores de superficie (SIEMPRE MANTENER LAS CÉLULAS EN FRÍO)
  7. Finalmente resuspender las células en HBSS+frío con 2 µg/ml de Ioduro de Propidio (no es necesario pero sí muy aconsejable)
  8. Analizar las muestras lo antes posible manteniéndolas en frío incluso durante el análisis (se evita la pérdida de la tinción)*

* Se requiere láser UV, los filtros adecuados y refrigeración de la muestra (FACSVantage del Servicio de Citometria: pedir cita previamente)

IMPORTANTE: Para confirmar la identificación correcta de la SP es necesario el uso de Verapamil (50 µM) o similar durante la incubación con el colorante (inhibidores de la bomba transportadora que elimina el Hoescht de las células progenitoras) y/o la tinción con marcadores específicos de esa población.

Material requerido:

  • Hoescht 33342 (Servicio de Citometría Sigma B2661): stock 5 mg/ml a -20ºC (50µl/alícuota), no reutilizar
  • DMEM+: DMEM (Servicio de Cultivos) suplementado con 3% de FCS y 10mM de HEPES
  • HBSS+ (Servicio de Cultivos) suplementado 10mM de HEPES
  • Ioduro de propidio (Servicio de Citometría Sigma P4170): stock 0.1 mg/ml a 4ºC 200µl/alícuota
  • Verapamil (Servicio de Citometría)
  • Marcadores de células progenitoras u otras drogas inhibidoras (usuario)

*Protocolo adaptado de Goodell M.A

Preparación de muestras para sorting

Antes de realizar una separación celular hay que definir una serie de parámetros que permitirán elegir adecuadamente cuales deben de ser las condiciones específicas de la separación. Los parámetros más importantes que debes de comunicar al Servicio de Citometría son:

  • Tipo celular: determina el tamaño boquilla y el tampón de sorting
  • Fluorescencias en base a las cuales se define la selección: define la línea de láser,los filtros,los controles de fluorescencia necesarios,etc.
  • Abundancia relativa de la población de interés. Numero de células necesarias y pureza requerida: define el modo de sorting, la velocidad, la concentración celular de la muestra...
  • Aplicación después del sorting: “esterilización del equipo”
  • Agentes biológicos de la muestra: rellenar documento control Seguridad Biológica (dicho documento ha de ser firmado por el jefe de linea).

Es posible que sea necesario realizar una prueba a pequeña escala antes del experimento definitivo para establecer alguno de estos parámetros.

Parámetros importantes de la preparación de muestras para sorting

  • Es importante que la muestra no contenga muchas células muertas o dañadas
  • En el caso de células adherentes es muy importante tripsinizar bien para evitar agregados celulares
  • Resuspender la muestra en tampón de sorting. El Servicio de Citometría te lo proporcionará (PBS, 5mM EDTA, 25mM HEPES pH7.0 en el caso de células adherentes o PBS, 1mM EDTA, 25mM HEPES pH 7.0 para células en suspensión) suplementado con un 2% de suero fetal bovino. En el Servicio de Citometría filtrará la muestra con un filtro de 30 ó 70 um
  • La concentración celular de la muestra dependerá del tipo celular. En general 4-6 millones de células/ml líneas celulares y cultivos primarios adherentes o de gran tamaño y 20 millones de células primarias no adherentes
  • Recogida de muestras, dependerá del tipo de muestra, pero en general, falcons de 15 ml con 2 ml de suero fetal (2 tubos por muestra a recoger) suplementado con antibióticos

Fluoróforos

ESQUEMAS COMBINACIONES DE FLUORÓFOROS MÁS HABITUALES EN CF:

TABLAS LONGITUDES DE ONDA EXCITACIÓN/EMISIÓN FLUORÓFOROS:

SOFTWARE ESPECTROS FLUORÓFOROS:

Normas y modo de uso

Calendario de reserva

PPMS en el Servicio de Citometría (https://ppms.eu/cbmso/login/?pf=3)

Para poder realizar reservas de los equipos del Servicio de Citometría de Flujo del CBMSO es necesario que el usuario esté dado de alta en el sistema de reservas PPMS. Dicho sistema lo comparten los Servicios de Microscopía Óptica y Confocal, Genómica y Secuenciación Masiva y Citometría de Flujo del centro. De este modo  cada persona (no cada grupo) tendrá asignado un usuario y una contraseña que le permitirá acceder al sistema de reservas de los tres Servicios mencionados. Dicho usuario y contraseña estará asociado a un IP y un número de cuenta. Si no tienes cuenta creada ponte en contacto con nosotros a través del propio PPMS, por teléfono, personalmente o por email.

Funcionamiento del sistema en los Equipos de citometría:

    • ORDENADORES DE ANÁLISIS

Una vez dados de alta en el sistema, el usuario podrá reservar estos equipos automáticamente. Los cursos de análisis de datos no son necesarios para poder utilizar los ordenadores, aunque sí aconsejables. No existe, de momento, ninguna limitación en cuanto al número de horas que un usuario puede reservarse. No obstante se ruega reservarse siempre y ajustarse en la medida de lo posible al tiempo reservado.

      • FACTURACIÓN: El uso de los ordenadores de análisis no se factura.
    • SEPARADOR CELULAR

Todos los usuarios del sistema podrán ver y reservar el separador celular FACSVantage SE. No obstante, esta reserva, que aparecerá en azul en el sistema, tendrá que ser validada por el personal del Servicio. Para poder reservaros tenéis que completar un formulario con la información específica del tipo de separación. Este formulario será enviado al personal del Servicio, (también podéis darnos esa información personal o telefónicamente). El personal del Servicio ha de modificar si es necesario y validar SIEMPRE la reserva hecha por el usuario. A partir de ese momento la reserva aparecerá en color verde como confirmada.

      • FACTURACIÓN: se realizará siempre por uso real del equipo, no penalizando la cancelación de una separación si es por causa justificada (contaminación, muerte…), aunque sí las demoras.
    • CITÓMETROS ANALÍTICOS

Para poder reservar estos equipos es necesario que el personal del Servicio haya validado su autonomía en cada uno de ellos, para ello se requerirá que:

ü El usuario haya superado la formación práctica básica correspondiente (Curso manejo citómetros analógicos (FACSCALIBUR), Curso manejo citómetros digitales con o sin HTS (FACSCANTO))

ü Tener al menos 5h de experiencia en esos citómetros con ayuda, bien proporcionada por personal del servicio, o bien por otro usuario ya autónomo.

ü Solicitarlo y que el personal del Servicio lo apruebe.

      • FACTURACIÓN:
        • En todos los citómetros se facturarán las horas reservadas.
        • Si una reserva es cancelada con menos de dos horas de antelación será facturada.
        • Los citómetros digitales, FACSCanto II y FACSCanto A, disponen además de un sistema que permite controlar el tiempo real de uso real del equipo. Por ello en estos equipos será necesario introducir vuestro usuario y password del PPMS al encender el ordenador para poder utilizarlo (de manera análoga a lo que hacéis en los FACSCaliburs con el login y password de vuestro laboratorio). OJO: en estos equipos el tiempo facturado será: reserva + tiempo usado fuera de la reserva) por lo que es importante en estos equipos especialmente que os ajustéis al tiempo reservado, y si no lo vais a hacer, que modifiquéis las reservas.

Encender y apagar el citómetro

FACS CALIBURS:

PARA EMPEZAR:

      • Encender por este orden: el láser, la bomba del tanque del sheath y el ordenador (esperar al menos 30 segundos para asegurar que el citómetro será detectado). Purgar el equipo (prime) y asegurarse de que no hay burbujas en el circuito
      • Comprobar que el tanque del sheath está lleno (2/3) y el tanque del waste vacío y dejarlo de este modo al finalizar de pasar tus muestras.

AL TERMINAR:

      1. Si no eres el último usuario del día:
        • Lavado corto: Pasar "clean" (lejía diluida comercial BD) 2ml con el brazo-soporte "abierto" y 5 minutos con el brazo soporte "cerrado" repetir lo mismo con agua destilada
        • Dejar la bomba del tanque del sheath en posición OFF siempre que no se estén pasando muestras para evitar el gasto innecesario de FACSFlow
        • Apagar el equipo si no se va a utilizar en los próximos 30 minutos (importante: el láser del equipo requiere al menos 20 minutos de reposo entre encendidos)
      2. Si eres el último usuario del día:
        • Lavar
          • Adquirir FACSClean: 2ml con el brazo-soporte "abierto", y 5 minutos con el brazo soporte "cerrado"
          • Adquirir FACSrinse: los primeros 2ml con el brazo-soporte "abierto", 5 minutos con el brazo soporte "cerrado" de manera estándar: con el brazo soporte "cerrado"
          • Adquirir agua destilada: los primeros 2ml con el brazo-soporte "abierto", y 5 minutos con el brazo soporte "cerrado"
        • Apagar el equipo

PARA APAGAR EL EQUIPO: Apagar por este orden: la bomba del tanque del sheath, el ordenador y el láser.

IMPORTANTE: Si no tienes que apagar el equipo NO APAGUES TAMPOCO el ordenador, simplemente haz log off para abandonar tu sesión (icono de la parte superior derecha de la barra de menú)

Software control de uso FACSCaliburs (FileGuard)

  1. Para poder utilizar el ordenador del citómetro tenéis que seleccionar vuestro "user" y poner vuestro "password"
  2. Cuando terminéis de trabajar tenéis que salir del software (para que la facturación corresponda con vuestro tiempo de uso del citómetro):
    • Si tenéis que dejar el citómetro y el ordenador encendidos porque otro usuario lo va a utilizar en los próximos 30 minutos debéis seleccionar el icono del software FileGuard (está en la esquina superior derecha de la pantalla y parece hoja cruzada por dos flechas) y marcar "Log Off"
    • Si el próximo usuario no va a utilizar el citómetro en los próximos 30 minutos tenéis que apagar el citómetro y el ordenador. Para apagar el ordenador tenéis que hacerlo desde el sistema operativo (en "especial": "shut down"). Esta operación registra de forma automática en el software FileGuard que vuestra sesión de trabajo ha terminado.

El software FileGuard sirve para facturar el tiempo de uso del citómetro, pero no controla ninguna de las funciones de encendido y apagado del citómetro. Por ello, es muy importante que respetéis los tiempos y tipos de lavado, que no dejéis encendido el láser si el citómetro no se va a utilizar durante 30 minutos y que la bomba del sheath esté en OFF siempre que no se estén pasando muestras.

Almacenamiento de datos

Los archivos de datos generados en el citómetro no deben permanecer en el ordenador que controla directamente el citómetro. Después de pasar muestras en el citómetro los archivos deben trasladarse al ordenador de análisis. En el ordenador de análisis están instalados los software Cell Quest,FlowJo, Photoshop y Powerpoint, lo que permite trabajar con los archivos de datos obtenidos en el citómetro (imprimirlos y/o preparar montajes de figuras para presentaciones de diapositivas o publicaciones). Los archivos de datos pueden permanecer durante periodos cortos de tiempo (hasta 4 semanas si que ocupan menos de 100MB) en el disco duro del ordenador de análisis, pero los usuarios deben encargarse de grabar y borrar sus archivos con objeto de no saturar la memoria del ordenador y almacenar de forma segura sus datos.

PASAR LOS DATOS A LOS ORDENADORES DE ANÁLISIS

¿CÓMO CONECTARSE A LOS ORDENADORES DE ANÁLISIS DESDE LOS ORDENADORES DE LOS CITÓMETROS?

      1. COMPROBAR QUE EL ORDENADOR DE ANÁLISIS ESTÁ ENCENDIDO
      2. IR A LA MANZANITA de COLORES (ARRIBA A LA IZQUIERDA)
      3. IR A FAVORITES
      4. HACER CLICK EN FAVORITES
      5. HACER CLICK EN CITO
      6. PONER CITO DE PASSWORD y CITO de USUARIO
      7. HACER CLICK EN CONNECT
      8. APARECERÁ UN ICONO de nombre CITO en el escritorio y se abrirá automáticamente, es el ordenador de ANÁLISIS guardar los datos en la carpeta de usuarios de vuestro laboratorio dentro de la carpeta DATOS-USUARIOS. Comprobar que se han pasado correctamente y BORRARLOS del ordenador de adquisición
      9. PARA DESCONECTARSE ARRASTRAR EL ICONO A LA PAPELERA

Posteriormente, para grabar/eliminar vuestros datos del ordenador de análisis podéis:

      • Grabar en un CD o DVD
      • Copiar vuestros datos en Novacripta/Bacterio
      • Utilizar memorias USB

Normas importantes

NORMAS IMPORTANTES PARA EL USO DE LOS CITÓMETROS FACSCALIBUR:

    • Es MUY IMPORTANTE ser muy rigurosos con los protocolos de lavado de los equipos
    • Es muy importante que la bomba del sheath este en OFF siempre que no se estén pasando muestras
    • Consultar el calendario de reserva on-line para saber si tenéis que apagar o dejar encendido el citómetro (apagarlo siempre que nadie lo vaya a utilizar en los próximo 30 minutos). Podéis consultar los calendarios de reserva online desde los ordenadores de análisis, que tienen SAFARI como navegador
    • Los datos no deben permanecer en el ordenador del citómetro. Después de pasar muestras en el citómetro los archivos de datos deben trasladarse al ordenador de análisis (ver en Normas y Modo de uso=>Almacenamiento datos como pasarlos al ordenador de análisis), donde pueden permanecer hasta 4 semanas (si ocupan menos de 100MB). Los usuarios deben encargarse de grabar y almacenar de forma segura sus datos, así como de borrar sus archivos con objeto de no saturar la memoria de los ordenadores

Bibliografía

Libros de consulta en el SCF del CBMSO:

Revistas on-line de consulta en CBMSO:

Funciones

Las funciones principales del Servicio de Citometría son:

  • Ofrecer la posibilidad de utilizar técnicas basadas en la citometría de flujo a grupos de investigación del CBMSO que no están familiarizados con esta técnica
  • Asesorar a los usuarios sobre las prestaciones de la técnica de citometría de flujo analítica y su mejor aprovechamiento
  • Desarrollar y optimizar nuevas aplicaciones incorporando nuevos reactivos
  • Realizar aislamientos celulares por cell sorting

A continuación se describen detalladamente las actividades que el Servicio de Citometría de Flujo del CBMSO lleva a cabo:

Asesoramiento y formación a los usuarios del Servicio

  1. Diseño de protocolos para la preparación de las muestras:
    • marcaje de membrana
    • marcaje intracelular
    • marcaje mixto membrana/intracelular
    • ciclo celular/apoptosis
    • exclusión de células muertas por tinción con IP
    • cuantificación de la eficiencia de transfección (ej: expresión de GFP)
  2. Utilización de los softwares de los citómetros (Cell Quest y FlowJo). Creación de planillas para la adquisición de muestras:
    • diseño de histogramas
    • sorting electrónico
    • creación y almacenamiento de ficheros lmd
  3. Ajuste de las condiciones de adquisición específicas: potencia y compensación entre fotomultiplicadores (InstrumentSettings):
    • tamaño y fluorescencia basal de poblaciones
    • compensación entre fluorescencias
    • utilización de la línea de láser 633nm ("segundo láser")
  4. Análisis y presentación de resultados. Utilización de software específicos: Cell Quest, FlowJo, ModFit y WinMDI.
  5. Bibliografía especializada.

Aislamiento celular por cell sorting

  1. Diseño previo de protocolos para la preparación de las muestras:
    • Marcaje: elección de fluorocromos y configuración de filtros para su detección
    • Concentración celular
    • Tampón
    • Filtrado de muestra
  2. Optimización individualizada de las condiciones del sorting:
    • Modalidad de sorting: rendimiento versus velocidad
    • Tamaño de partículas: tipo de boquilla
    • Alineamiento de láser/láseres
    • Ajuste de condiciones específicas para el sorting: presión de sheath, frecuencia de inducción de formación de gotas, carga de placas deflectoras, ajuste del "drop delay"
    • Esterilización del equipo
    • Separación
    • Reanálisis: evaluación de la pureza tras la separación

Mantenimiento de los equipos

  1. Establecimiento de los protocolos y normas para la utilización de los equipos: procedimientos a seguir para su encendido, lavado y apagado
  2. Mantenimiento periódico de los citómetros: calibración
  3. Gestión de las reparaciones en caso de avería
  4. Pedido de reactivos y componentes necesarios para el funcionamiento de los equipos

Desarrollo de nuevas aplicaciones

  1. Desarrollo de nuevas aplicaciones de citometría de flujo analítica:
    • Análisis multiparamétricos complejos: combinaciones de fluorocromos compatibles (líneas de láser y filtros necesarios para su detección)
    • Genes reporteros: variantes de GFP
    • Amplificación de señal
    • Medida de la proliferación celular: CFDA, BrdU
    • Ciclo celular: ciclinas, DNA
    • Activación celular
    • Transducción de señales
    • Secreción de citoquinas mediante ensayo multiplex
    • FRET
    • Ciclo celular en células de drosófila
  2. Desarrollo de nuevas aplicaciones de separación celular por cell sorting. Optimización y puesta a punto de las distintas opciones del equipo de separación celular por cell sorting:
    • Turbosort Plus: para realizar separaciones celulares en condiciones de alta presión/velocidad
    • Macrosort Plus: para la separación de partículas de gran tamaño
    • CloneCyt Plus con Index Sort: sistema integrado de deposición de células en diferentes recipientes (placas multipocillo, portaobjetos, etc)

Tareas administrativas

  1. Contabilidad y facturación del servicio
  2. Presupuestos y peticiones de infraestructuras. Canalización de sugerencias
  3. Contacto con los representantes y el servicio técnico de las casas proveedoras

Desarrollo y mantenimiento de la página Web del servicio de Citometría de Flujo

Enlaces de interés